基因治疗的前世今生(九):编程时代(下)
我们已经知道,细菌的CRISPR/cas9系统是小小细菌用来对抗病毒入侵的秘密武器。 
2015-8-3 9:49:44
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王立铭

本文转载自以负墒为生




书接上回。我们已经知道,细菌的CRISPR/cas9系统是小小细菌用来对抗病毒入侵的秘密武器。依靠CRISPR片段对病毒DNA的精确定位,以及cas9蛋白对病毒DNA的高效切割,细菌在亿万年的生命史上确保自身的安全和生生不息的繁衍。而CRISPR精确定位基因组的能力,让梦寐以求开发新型基因组编辑和基因治疗技术的科学家怦然心动。


故事就从这里开始。


跨越半个地球的联手


实际上我们得说,道德纳的目标一开始并没有对准cas9这把基因组剪刀。严格说起来,在道德纳对CRISPR序列产生兴趣的2005年,细菌学家们尽管已经猜测出CRISPR RNA能起到基因组GPS的作用,但是对于CRISPR究竟如何定位、定位之后又是如何切割病毒基因组其实还相当模糊。人们大概知道,有一个庞大的蛋白复合体(名为Cascade)应该起到了剪刀的作用,但是因为这个复合体实在太大了,即便是道德纳这样的结构生物学老手,一直也没有能把它的精细结构看得很清楚。


直到2011年。


三月初,道德纳飞往美丽的加勒比海小岛波多黎各参加一场由美国微生物学会组织的会议。会议的主题是细菌中的RNA分子,这正是道德纳整个职业生涯一直关注的目标。从尚在浓雾时雨的北加州飞往阳光明媚的加勒比海,道德纳的心情无疑是轻松愉快的。


直到有一位表情严肃的女科学家走上前来,轻声问道:“能出去走走,顺便请教您几个问题么?”


这个女科学家是任教于瑞典于默奥大学的法国人艾曼纽.卡朋特(Emmanuelle Charpentier)。这场不期而遇的对话标志着人类基因治疗领域新的起点,毫无异议的将被写入当代科学史。


盛装亮相的两位女科学家。2014年11月,道德纳(左)和卡朋特(右)一同获得了由硅谷创业精英(包括脸书创始人Mark Zuckerberg,谷歌联合创始人Sergey Brin等人)设立的生命科学突破奖(Breakthrough Prize in Life Sciences),并获得了每人300万美元的奖金,这也是史上数额最大的科学奖项。


和道德纳一样,卡朋特也对CRIPSR序列有着特别的兴趣。而两人的研究背景却又大相径庭,和结构生物学出身的道德纳不同,卡朋特受过长期的细菌生物学训练,对细菌本身的生物学更加熟悉。而在这场对话中,卡朋特提到她自己的实验室在研究一种危险的人类致病菌——化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)——当中的CRISPR序列。她的实验室发现在这种细菌中,一种名叫cas9(当时的名字是csn1)的蛋白,似乎独立就可以完成利用CRISPR序列定位和切割病毒基因组的能力。这一点出乎道德纳(也包括领域中大多数科学家)当时的预料。因为按照当时的理解,人们一般认为识别和切割病毒基因组需要一大堆蛋白质的参与。


于是道德纳和卡朋特水到渠成的开始了她们的合作:对道德纳而言,研究一个蛋白质的结构和功能显然比研究一大堆蛋白质轻松得多;而对于卡朋特而言,她也非常想从结构生物学的角度,更好地理解cas9到底如何发挥功能的。


于是两个相隔万里之遥的实验室迅速的联起手来,他们的合作,最终在2014年完美解释了CRISPR/cas9系统的工作原理:cas9蛋白就像一个有着两块卡槽的接线板,能够同时插进一条CRISPR RNA,和一条病毒基因组DNA,而当CRISPR RNA和病毒DNA的序列一一对应时,cas9蛋白会发生变形,准确的卡住病毒DNA并毫不犹豫的挥起剪刀。这正是细菌免疫系统的工作原理。


但是她们俩的合作很快就有一个充满惊喜的副产品呱呱坠地。


2012年夏天,两个实验室联手证明,的确如卡朋特所猜想,体外纯化的cas9蛋白单独就可以发挥定位和切割基因组DNA的功能。更重要的是,她们发现,cas9蛋白定位的功能完全依赖于CRISPR RNA那么几十个碱基的序列信息,如果人工编辑CRISPR RNA,就可以让cas9蛋白指哪打哪,切割任意指定的DNA。这个结果清晰地指向了一种全新的基因组编辑技术:理论上人们只需要设计一段几十个碱基的CRISPR,然后加上天然存在的cas9蛋白,就可以随心所欲的定位和修改任何一段人类基因组了!


读者们别忘了,这时候,距离基于”神话“蛋白的上一代的基因组编辑技术问世也不过短短一年。当科学家们还在努力地学习”神话“蛋白的组装方法,生物技术公司们还在跃跃欲试的准备用”神话“蛋白展开基因治疗的尝试的时候,CRISPR/cas9技术从天而降,宣示了”神话“技术的终结:毕竟这一次,要定位任意一段人类基因组序列,只需要科学家设计几十个碱基长度的序列即可,把基因组编辑的工作量一下子降低了上千倍!


新技术走入现实,所有权大战揭幕


即便在几年后的今天,我仍然可以触摸到整个科学界对道德纳和卡朋特的发现的狂热。这不仅仅是一项可以帮助科学家定位和编辑基因组的基础研究手段,尽管这项技术几乎肯定会获得诺贝尔奖。如果这项技术确实如两位女科学家所言那么高效和便捷,也许整个基因治疗市场会被重新定义。谁能抢得先机,谁也许就能在这个广阔的舞台和市场上占据先发优势。


在2013年初短短数周时间内,三个研究组相继证明,人工设计的CRISPR序列与cas9蛋白结合,在人类细胞中同样可以高效的定位、剪切和修改基因组。这项人类基因组编辑的新技术正式走入现实。这三个研究组包括道德纳自己,也包括在”神话“蛋白技术的开发者、任教于哈佛大学医学院的乔治.钱奇(George Church)和任教于麻省理工学院布罗德研究所的张峰。


和以往的基因组编辑技术、例如锌手指蛋白技术和”神话“蛋白技术相比,CRISPR的优势实在是太过明显。一方面,从工具准备的角度看,设计和生产一个用于定位的CRISPR,对于任何一个稍经训练的生物学研究人员来说都是易如反掌的事情,远远简便于锌手指蛋白和”神话“蛋白的组装;另一方面,上述三个实验室的工作也证明,CRISPR系统工作的效率要远远高于其他两种技术,这意味着现实中改变任何生物乃至人类自身的基因组的成功率要高的多。甚至在上述张峰实验室的论文中,他们还证明可以一次性利用几个CRISPR来实现对基因组的多点精确打击,这是之前任何基因组编辑技术都无法达到的高效率。而在各种各样的工业应用中,高效率就意味着低成本,意味着短周期,意味着把许多不可能变为可能。


因此几乎在第一时间,资本疯狂涌入了这个看起来遍地黄金的市场。是啊,在如此高效的技术背景下,有太多太多愿景可以去自由畅想。我们是不是可以利用这项技术,修改各种农作物和农业牲畜的基因组,让它们更加高产、抗害、有营养?我们是不是可以改造各种工业微生物,让酸奶更可口,奶酪更香醇,葡萄酒更醉人?


而我们。。是不是也可以用它来修改受精卵的基因组、以避免先天遗传病;修改患者的基因组,治疗他们的病患;甚至让我们人类更聪明,更健康,更长寿?


有市场分析认为,几年之内以CRISPR为基础的基因组编辑市场会达到每年数十亿美元的市场规模。而更乐观的估计则认为,这是一个年销售额接近五百亿美元的庞大市场。要知道,当市场分析家做出这些预测时,CRISPR技术刚刚有了还远不算成熟的原型,连实验室应用都谈不上!


于是在全世界的实验室你追我赶的继续完善和发展CRISPR技术的同时,围绕着知识产权的战争开始了。这并不奇怪,我们在前面的故事里已经讲过专利的重要性。面对CRISPR/cas9这项具有巨大潜在经济利益的技术,谁拥有了它的知识产权,谁就有可能最大化市场收益。


2014年4月15日,美国专利与商标局(USPTO/US Patent and Trademark Office)在万众注目中,将与CRISPR/cas9技术相关的第一个专利,授予张峰所在的布罗德研究所,而张峰是专利的第一发明人。这项内涵及其深广的专利涵盖了CRISPR/cas9技术在所有真核生物——包括各种动物、农作物和人类自身——中的应用。


CRISPR/cas9技术的第一项专利许可,授予布罗德研究所和麻省理工学院,发明人张峰,授予日期2014年4月15日,专利编号US 8,687,359。(图片来自www.broadinstitute.org)


这项专利意味着,从此以后,任何公司如果试图利用CRISPR/cas9技术改造动物、植物、微生物乃至人类自己,必须首先从布罗德研究所获得专利授权,否则就侵犯了布罗德研究所的专利权。布罗德研究所靠这项专利不光可以坐拥主动送上门来的滚滚专利许可费,而且可以从源头控制整个基因编辑和基因治疗产业!


这边布罗德研究所的庆功酒还没开场,那边的枪炮番茄已经一齐丢了过来。围绕CRISPR/cas9技术的所有权问题,一场战争一触即发。


CRISPR到底是谁的?


等等,这里面是不是有几个问题?从我们的故事来看,CRISPR/cas9技术最早的发现者难道不是道德纳和卡朋特?为什么她们没有拿到专利?就算是张峰实验室确实最早证明这项技术在人类细胞中可以工作,那差不多同时哈佛大学的钱奇实验室、以及道德纳本人也证明了这一点,为什么专利不是三方共享?而且,就算专利局张峰的发现最为关键,那专利的持有人为什么不是张峰自己,而是张峰所工作的布罗德研究所?


这些问题听起来简单,想几句话给读者们交代清楚还真不容易。


先说简单的。雇员在工作中做出的成果,也就是所谓的“职务发明”,成果归属雇员还是雇主一般而言是个国家专利法的管辖范围。世界上大多数国家的专利法(也包括美国)都遵循“雇主优先”的原则,即知识产权归属雇主。事实上即便是非“雇主优先”系统的国家,雇主们一般也会在员工合同中就职务发明做出规定,例如强制雇员将发明所有权让渡给雇主这样的条款。因此,在绝大多数情况下,雇主自然的是雇员工作产生的知识产权的拥有者,这一点对于工作性质更多是自由探索的科学家来说也不例外。因此,张峰所在的布罗德研究所自然成为了这项专利的所有者。事实上,布罗德研究所的大股东,哈佛大学和麻省理工学院也自然的成为了这项专利的所有者,只是这两家不参与专利的日常管理而已。


那么为什么这样一个万众瞩目的专利滑落布罗德研究所,而没有道德纳和卡朋特他们什么事呢?


实际上,道德纳和卡朋特所在的加州大学和维也纳大学也绝不会无视CRISPR/cas9技术的巨大潜在利益,它们早在两位科学家的学术论文发表前,就已经在2012年6月份像美国专利与商标局提交了正式的专利申请。要知道,张峰和布罗德研究所的专利申请实际上要晚得多:要到2012年底,张峰实验室证明CRISPR/cas9技术能够应用于人类细胞基因组编辑的时候,才正式提交!虽说布罗德研究所的专利律师成功的走了条快速审查的绿色通道,缴纳费用让专利局先审查自己的专利,但是也不该这样就后来居上了呀?难道是专利局的人黑吃黑?


黑吃黑是没有的,但是这个问题说来就复杂了。


在世界上绝大多数国家的专利法系统里,如果出现不同人或实体试图申请同一类东西的专利的时候,一般遵循谁先申请谁能获得专利的排队规则(“first-to-file"),这样相对来说纠纷比较少,因为谁先递交的申请有据可查一目了然,也相对来说能够刺激发明人尽快申请专利。而美国长久以来采用所谓谁先发明谁能获得专利的规则的排队规则(“first-to-invent”),而且在长达十几年的时间里是全世界唯一一个还实行这种规则的国家。这种谁先发明谁获得专利的系统,看起来初衷当然是很理想主义的:专利应该保护真正率先将它实现的人,而不是那个急匆匆提交专利申请的人。但是这个系统在现实操作中却会遇到一个绕不过去的问题:专利申请人如何证明自己才是那个第一个发明的人?总不能靠自己红口白牙去说吧?可能也是基于这个理由,美国决定在2013年前后将专利法系统整个改革,追随一下“世界潮流”,也开始按照谁先申请谁获得专利的办法做事了。可是别忘了,不管是道德纳/卡朋特身后的加州大学系统,还是张峰身后的布罗德研究所,都是在2012年提交的专利申请,因此,专利局对他们两家专利权的认定,还是必须按照那个比较天真幼稚的“谁先发明谁获得专利”来。换句话说,想要打赢这场可能价值百亿美元的专利大战,双方必须提供充足的证据,证明自己一方率先发明了这项技术!




2011年9月16日,美国总统奥巴马签署批准美国发明法案,正式确定了美国专利法系统将于2013年3月16日转向谁先申请谁获得专利的”first-to-file“系统。不要小看了专利法范畴的这么个小小变化。对知识产权的保护是美国的立国精神之一。美国的立国之本、1787年美国宪法中,已经明文规定,为了保障科学和技术的进步,国会有权利授予作家和发明家著作权和专利权的保障。


就这一点而言道德纳和卡朋特本来是有天然的优势的,毕竟她们俩在2012年中率先发表论文证明了CRISPR/cas9技术的可行性,而张峰实验室的论文要到2013年1月才问世。然而有备而来的布罗德研究所一口气提交了上千页的原始证据,从基金申请书、个人通信记录一直到实验记录本,试图证明张峰实验室早在2012年初、道德纳/卡朋特的论文发表前已经独立发明了这项技术。与此同时,布罗德研究所的另一项有力指控是,尽管道德纳/卡朋特的论文说明CRISPR/cas9技术的可行性,但是张峰实验室却是首先证明这项技术能够应用于改造细胞内基因组的,因此如果想要在动物植物甚至人类的细胞中编辑基因组,理所应当从布罗德研究所获得授权。


听起来似乎说理充分论据十足,读者们可能已经觉得这项专利花落布罗德研究所是顺理成章了?


先别急,深感被忽悠和羞辱了的加州大学和道德纳/卡朋特一方显然不会那么容易放弃这只下金蛋的鹅。在一年的精心准备之后,加州大学于2015年4月向美国专利与商标局提交了多达114页的抗辩材料,以及几千页的补充证据。他们试图让美国专利局相信,布罗德研究所的专利无效,而加州大学才是这项技术真正的拥有者!加州大学提交的证据似乎也滴水不漏,一方面,他们试图说明,张峰实验室所提交的参考材料——包括实验记录本——仅仅能说明对方进行了相关的尝试,并未说明这些尝试真的成功了。其次,针对布罗德研究所所谓”率先在细胞内应用CRISPR/cas9技术“的声明,加州大学的立场是,从道德纳/卡朋特的论文中猜测和联想到这项技术能够用于细胞内是显而易见、顺水推舟的事情,根本不足以支持一项发明专利的创新性。


针尖对麦芒,三个CRISPR领域世界顶尖的实验室,两家在生物医学领域引领时代的研究机构,就这么宣战了。事实上,加州大学的抗辩宣告了关于CRISPR所有权的争议几乎已经不存在任何和解的可能,如果专利局判定加州大学的抗辩有效,那么布罗德研究所就将失去围绕CRISPR的一切知识产权;反过来如果专利局裁定加州大学抗辩无效,那么道德纳他们只能两手空空的看着布罗德研究所从此独占基因组编辑和基因治疗这个巨大市场。


于是整个世界,都开始屏息等待美国专利局的裁决。上一次一纸薄薄的专利授权书吸引全世界的目光,可能要追溯到近一百年前,天才的勤杂工、发明家费罗.法恩斯沃斯(Philo Farnsworth)赢得了与巨无霸美国广播公司(Radio Corporation of America, RCA)的专利权官司,捍卫了自己电视发明人的地位!


费罗.法恩斯沃斯,电视之父,美国的国家英雄。对于中国的读者来说,电视发明人的称号往往和另一位发明家,英国的贝尔(John L Baird)联系在一起。实际上,贝尔确实是世界上第一台电视的发明人,但是日后使用更加广泛的阴极射线管电视(也就是我们耳熟能详的显像管电视)则出自法恩斯沃斯之手。法恩斯沃斯虽然成功捍卫了自己的电视专利和电视之父的称号,但是本人却没有从电视的商业化中获利。(图片来自www.kbyutv.org)


基因治疗,下一个光荣和梦想


专利所有权之争,似乎并没有阻挡资本的脚步。


尽管现在谁都难以预测CRISPR技术的专利终将花落谁家,又或者是否能以一种共赢的方式达成和解,投资人和医疗行业巨头们对这项技术的兴趣还是在不断高涨着。


我们在这个基因治疗系列故事里面反复讲到过不同遗传疾病的例子,也讲到过不同历史时期,人们利用不同的基因组改造技术试图征服遗传疾病的尝试,有辉煌的成功,也有惨痛的失败。


但是大体而言,基因治疗领域始终在紧跟着基础研究的步伐。在上世纪九十年代,人们已经开始利用病毒载体,把DNA以一种”缺啥补啥“的逻辑补充到基因缺陷疾病患者的体内。等到更精细的基因组编辑技术——包括锌手指蛋白和”神话“蛋白——出现,人们开始看到希望,这些对基因组进行精确定位和编辑的技术,也许能够极大地完善基因疗法的技术手段。毕竟,传统基因疗法仅仅是把出现缺陷的DNA重新放回患者体内,至于放回的效率、数量和地点都难以控制。如果说新兴的基因组编辑技术像是高精度的巡航导弹,传统的基因疗法可能最多算是大炮炮弹,有杀伤力,但是太粗放、太低效、太有破坏性。


CRISPR/cas9技术的登场,把基因治疗的武器库升级到一种前所未有的高度:它的设计和制造极其简单,技术门槛很低(只需要设计一段几十个碱基构成的CRISPR序列);它的打击效率非常高,甚至可以实现一次发射、多重打击(可以一次基因治疗使用多个CRISPR片段,同时修改几个疾病位点);它的打击方式更加多样化(人们已经证明,使用CRISPR、cas9技术,可以对特定基因组位点实现删除、修复、替换等等功能)。


因此尽管专利权之争尚未尘埃落定,针对CRISPR技术的研究和临床应用已经蓬蓬勃勃的开展起来。


CRISPR/cas9技术商业化的”四国大战“。四家公司的核心技术平台和发展方向可能极为接近,在未来他们将会发展出不同的疾病方向,亦或是将会联手攻克某种疾病,让我们拭目以待!(图片来源:www.biopoliticaltimes.org) 


而这次的竞争,大概要比专利权之争更为复杂。加州大学的道德纳参与成立了Caribou Biosciences和Intella Therapeutics两家公司,并且从她所工作的加州大学那里获得了CRISPR专利的独家授权(是的,即便是尚未获得批准的专利也可以授权)。其中Intella的主攻方向即是利用CRISPR/cas9技术进行人体基因治疗。道德纳的合作伙伴卡朋特参与成立了总部位于瑞士巴塞尔的CRISPR Therapeutics公司;而道德纳的直接竞争者、哈佛的钱奇与布罗德的张峰则联手创立了Editas Medicine公司。这四家公司其实都没有公开太多公司发展方向和技术手段的细节,但是毫无疑问,利用CRISPR/cas9技术进行人体基因治疗将是重中之重。有Sangamo的教训在先,我倒是很开心看到这样的竞争。要知道,这些最天才头脑之间的竞争和碰撞,带给我们的惊喜,也许会远远超过我们哪怕是最狂热的想象。


而我们的基因治疗故事,也就到了该结束的时候。


希望在这个故事里,读者们看得到许许多多隐藏在进化背影里的奇妙现象,如何一点一点被人类好奇的眼光所注视、所理解;看得到人类探索自然奥秘的道路上有多少曲折反复,也有多少激动人心的高光时刻;看得到有多少实验室里不经意间的有趣发现,会用一种巧夺天工的方式最终造福人类自己。


可能我们这种跳得不高、飞的不远、力气也不大的卑微的碳基生命,就是这样走出非洲、在全世界开枝散叶建立文明;也正是这样把飞船送出太阳系、把眼光投向亿万光年之外和原子之间。


而我们对自身遗传信息的编辑和修改,会不会是这漫漫征途上,下一个光荣与梦想?毕竟,这也许是造物以来,有机生命第一次有能力有意识的改造自己!

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